實驗名稱：超聲實現(xian)離(li)體(ti)H-22腫瘤細胞快速磁性標記研究

　　研究方向：生物醫(yi)學

　　測(ce)試目的：

　　細胞磺性標記(ji)所(suo)采(cai)用的標記(ji)物多為超順(shun)磁氧化鐵(SPIO)納米微粒，由于細胞膜表面和SPIO表面都帶負電荷，二者相互排斥，細胞在自然狀態難以攝取氧化鐵顆粒。為提高細胞標記率，達到磁性標記細胞的目的，一般都是通過載體或轉染劑對顆粒表面進行修飾，通過吞噬、液相胞飲等作用促進細胞對它們的攝取。近年還有人將磁性粒子與抗體和受體結合，通過細胞表面相應的受體使磁性粒子與細胞結合并進入細胞內。還可將磁性氧化鐵粒子制成特定的標記物，通過哺乳類動物細胞非特異性膜表面吸收過程進入細胞內，用SPIO對目標細胞標記時，將SPIO與與轉染試劑通過一定方式復合，然后與目標細胞一起放入培養基中共同培養，一般需要較長的孵育時間(24一48h)。SPIO微粒通過非特異性膜表面吸收過程進入細胞內。

　　葡聚糖包被的超小型超順磁納米(mi)粒子是目前(qian)應用最為廣泛的磁共(gong)振成(cheng)像對比劑，最早(zao)被用于體外細胞磺性標記(ji)試驗。但(dan)相比于標準尺寸(50-150nm)或微米級的氧化鐵微粒對比增強效果也較弱。使用體積大些的葡聚糖包被的SPIO標記細胞時胞質內Fe顆粒較顆粒小者多，標記效果好。另外，用大尺寸的如微米級尺寸的氧化鐵微粒可實現對單個細胞的磁標記進而實現單細胞的磁共振成像。這也是目前一個嶄新的研究方向，但由于細胞膜的保護作用，如何將這些大尺寸的氧化鐵微粒加載進入細胞質中是一個有待解決的問題。

　　測試(shi)設備：ATA-8202射頻功率(lv)放(fang)大器、信號發生器、超聲探頭(tou)、水(shui)槽(cao)、蒸餾水(shui)等。

　　實(shi)驗過程：

　　利用化學共沉淀法自(zi)行合成葡聚糖包被的超順磁(ci)納米氧化鐵水(shui)基磁(ci)懸液，其核心(xin)顆(ke)粒直徑10~20nm，濃度可以根據需要自行調整。在此之前，曾經采(cai)用生化孵育的安全質(zhi)量分(fen)數為(wei)25ug/mL且在輸(shu)出電功率1W的條(tiao)件下進行了裝載實驗，發現作用時間在2min以內該功率的超聲對細胞活性幾乎沒有影響，但由(you)于細胞懸液(ye)中SPIO微粒濃度太小，裝載效(xiao)果不理想。所以本(ben)次實驗選用較大的SPIO濃度，按其(qi)在細胞懸液中的最終濃度(du)分為A、B、C、D、E5組，各組質量分數為分別為22.5、90、410、1500、2250ug/mL且使(shi)超(chao)聲(sheng)發生器輸出電功率為2W時進(jin)行超(chao)聲(sheng)裝載實驗(yan)，實驗(yan)裝置如(ru)圖：

圖1：實驗裝置

　　實驗結果：

　　本(ben)次實驗考(kao)察當探頭激勵頻率1.43MHz，發生(sheng)器輸出(chu)電功率(lv)2w，細胞懸液中所含SPIO質量分數在22.5~2250ug/mL，，超聲作(zuo)用時間(jian)在(zai)10~120s條件下，細(xi)胞標記情況及活性。

　　1、細胞(bao)標記結果

　　普(pu)魯士藍顯示陽性的為(wei)已標記的細(xi)胞(bao)，當SPIO在細胞懸液中質量分數為410ug/mL，超(chao)聲發(fa)生器輸(shu)出電功率為2w，探頭中心(xin)頻率1.43MHz，超聲(sheng)作(zuo)用10s時H-22細胞的標記效果，細胞陽性率約為(wei)82%。而未經超聲(sheng)處(chu)理的細胞懸液，將(jiang)其與納米(mi)超順磁(ci)氧化鐵水(shui)基磁(ci)懸液(ye)一起在37℃孵育箱中孵育30min，然后用普魯士染色，光鏡(jing)下(xia)觀察，幾乎沒有細(xi)胞被標記，可見不經超(chao)聲處理，僅進行短時間孵育細胞是(shi)不(bu)能實現細胞標記(ji)，也就是說在沒有超聲的參與情(qing)況下，短(duan)時間(jian)內SPIO微粒不能夠進入細胞內。證明超聲作為(wei)一種外(wai)界(jie)力量確實可以使大顆粒物質(zhi)一納(na)米氧(yang)化鐵微(wei)粒進入細胞，實現(xian)細胞磁性(xing)標(biao)記。

為了研究細胞的標(biao)記率(lv)與超(chao)聲(sheng)處理時間、SPIO濃度之間的量化關系，在聲(sheng)學條(tiao)件為1.43MHz，輸出電功率為2W時，對不同的超聲處(chu)理時(shi)間、SPIO濃度條件下，任取10個顯微視野進行計數，統(tong)計SPIO對細胞的標記率。統計結果顯示不同SPIO濃度時細胞標記率(%)與超聲處理時間t(s)之間的關系如圖2。

圖2不同SPIO濃度時超聲輻射時間與細胞標記率之間的關系

　　特定SPIO濃度時，標(biao)記率和超(chao)聲作用(yong)時間的關系(xi)：當(dang)SPIO質量分數為22.5ug/mL時，隨著超聲(sheng)作用時(shi)間增長(chang)，細胞標(biao)記率近(jin)似(si)直線提高，但從整(zheng)體來看，細(xi)胞標記(ji)率較低，當超聲作用時(shi)間(jian)為120s時，標記率(lv)不足25%。當(dang)加入的SPIO質量分數為90~2250ug/mL時，標(biao)記率和超聲(sheng)作用時(shi)間呈(cheng)現振蕩(dang)關系(xi)。除410ug/mL外，超聲(sheng)作用時間低于30s，隨時間延長(chang)標記率下降。30~60s之間，隨時間延長，標記率提高；60s后，隨時間延長，標(biao)記率又呈下降趨勢。

超(chao)聲作用時(shi)間一定，標記率和SPIO濃度間關系，從整個(ge)標(biao)記結(jie)果來看，超聲作用時(shi)間(jian)在60s內，細胞標(biao)記率(lv)相(xiang)對較高(gao)，超過60s后，標記率基(ji)本都在下降。當超(chao)聲作用時間(jian)為30s，SPIO質量分(fen)數為410ug/mL(C組)，細胞標記率超過(guo)90%，SPIO質量分數過高(如1500ug/mL(D組)和2250ug/mL(E組))或(huo)質量分數過低(di)(如22.5ug/mL(A組))細胞標(biao)記(ji)率均不(bu)足20%；說明SPIO在對H-22細胞標記時存在一個最佳濃度，濃(nong)度(du)過高或過低(di)，都會(hui)使標記(ji)效果變差。

　　標記率與(yu)SPIO質量分數、超聲作用時間之間確切關系還需進一步研究。

　　安泰ATA-8202射頻功率放大器：

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