實驗名稱(cheng)：聚焦超(chao)聲對(dui)S180腫瘤細胞膜理化性質的影響

　　研究方向：生物醫療

　　測試目的(de)：

　　細(xi)胞(bao)(bao)膜是細(xi)胞(bao)(bao)生(sheng)命活動(dong)中有著復(fu)雜功能的(de)重要(yao)結(jie)構其(qi)基本作用在于維(wei)持細(xi)胞(bao)(bao)內外(wai)環境的(de)相對(dui)穩定而其(qi)通透性、完整(zheng)性及流(liu)動(dong)性等(deng)理化性質(zhi)(zhi)則與胞(bao)(bao)內外(wai)信息(xi)傳遞、物質(zhi)(zhi)能量交換等(deng)多(duo)種功能有著密(mi)切的(de)關系?膜的有序結構影響著生命活動的正常進行。當細胞癌變后?癌細胞膜更新較快?比正常細胞更易受到外界環境的影響?因此成為近年來腫瘤細胞分子生物學研究的熱門領域。有實驗發現?超聲在處理細胞時?可促使細胞膜局部破裂?從而改變細胞質膜的通透性使胞內物質釋放或使胞外物質進入細胞?進而影響細胞執行正常的生理活動。超聲的作用機制一般包括：機械作用、熱效應和空化作用，有研究表明主要是超聲空化作用引起的機械剪切力和熱效應導致細胞膜改變，但其具體的作用機制并不清楚。因此本實驗采用超聲頻率為2.2MHz?篩選最佳的聲照強度及處理時間以作用于S180腫瘤細胞?通過檢測細胞內FD500的陽性染色率和熒光強度、乳酸脫氫酶釋放量及膜流動性的改變以研究超聲對S180細胞膜的損傷作用；并初步探討單純聚焦超聲造成這些改變的具體作用機制。

　　測試設備：ATA-8202射頻(pin)功率放大(da)器、有流式細胞儀、熒光顯微(wei)鏡。

　　實驗(yan)過(guo)程(cheng)：

　　接種S180腫瘤細胞于ICR系健康小白鼠腹腔1周左右，收集腹水細胞并稀釋，重懸于0.85％生理鹽水，調節細胞密度為1.0×10⁶cells／ml，同時臺盼蘭(lan)染色計數保證細胞存活率在99％以(yi)上(shang)。將(jiang)細胞分裝(zhuang)在醫用一次性(xing)(xing)薄壁采血管(guan)(guan)中（1ml／管(guan)(guan)），并隨機分為對照組(zu)(zu)（CT）和不(bu)同超(chao)聲處理(li)組(zu)(zu)（U），每組(zu)(zu)三管(guan)(guan)然后進行聲超(chao)處理(li)，實驗至少重復三次以(yi)確認(ren)結(jie)果的可靠性(xing)(xing)。

　　采用頻率(lv)為2.2MHz聲照時間為60s，超聲強度分別為0、1、2、3、4、5、6、7W／cm²；采用聲(sheng)照強(qiang)度為3W／cm²，處理時間分別為0、15、30、45、60、90s作用于S180細胞。臺盼蘭拒染法檢測不同處理后細胞的相對存活率，臺盼蘭配成0.4％的染(ran)液，聲(sheng)照(zhao)處理后(hou)取部分細胞懸液用臺盼蘭染(ran)色后(hou)在光鏡下(xia)用血細胞計數(shu)板(ban)計數(shu)。細胞相對存(cun)活(huo)率計算公(gong)式：存(cun)活(huo)率＝實驗組(zu)拒(ju)染(ran)細胞數(shu)／對照(zhao)組(zu)拒(ju)染(ran)細胞數(shu)×100％。

　　收(shou)集S180腫瘤細胞并稀釋調整細胞密度為1.0×10⁶cells／ml，分(fen)(fen)裝(zhuang)于一次性醫用(yong)采血管(guan)(guan)中（1ml／管(guan)(guan)）。將各管(guan)(guan)細(xi)(xi)胞(bao)隨(sui)機分(fen)(fen)為1個(ge)對(dui)照(zhao)組(zu)(zu)和2個(ge)實(shi)驗(yan)(yan)組(zu)(zu)（不同(tong)聲(sheng)照(zhao)時間組(zu)(zu)），每組(zu)(zu)3管(guan)(guan)。其中對(dui)照(zhao)組(zu)(zu)每管(guan)(guan)加50μl生理鹽(yan)水，各實(shi)驗(yan)(yan)組(zu)(zu)每管(guan)(guan)避(bi)光加入50μlFD500工(gong)作液(ye)（終(zhong)濃度為10mg／ml），輻照(zhao)實(shi)驗(yan)(yan)完畢，即(ji)刻離(li)心收(shou)集細(xi)(xi)胞(bao)，用(yong)PBS反復洗滌，懸浮，高速(su)離(li)心以除(chu)凈(jing)細(xi)(xi)胞(bao)外FD500。流式細(xi)(xi)胞(bao)儀(yi)檢測熒光染色陽(yang)性細(xi)(xi)胞(bao)（FD500進入細(xi)(xi)胞(bao)）每個(ge)樣品檢測1.0×10⁴個(ge)細(xi)胞(bao)(bao)；同時熒(ying)光顯微鏡(jing)觀察熒(ying)光染色陽(yang)性(xing)細(xi)胞(bao)(bao)，至少觀察十個(ge)視野并以CCD捕捉圖像（×40）。

　　LDH釋放是細胞(bao)膜損傷的(de)(de)敏感指標(biao)之(zhi)一，實驗完畢后，采用LDH試(shi)劑盒測(ce)定(ding)各組細胞(bao)膜的(de)(de)損傷程度，步驟(zou)嚴(yan)格按(an)照試(shi)劑盒說明(ming)書進行。計算(suan)公式(shi)：LDH活(huo)性（U／L）＝（測(ce)定(ding)空(kong)白(bai)(bai)管(guan)(guan)(guan)吸光(guang)度值(zhi)(zhi)－空(kong)白(bai)(bai)管(guan)(guan)(guan)吸光(guang)度值(zhi)(zhi)）／（標(biao)準(zhun)管(guan)(guan)(guan)吸光(guang)度值(zhi)(zhi)－標(biao)準(zhun)空(kong)白(bai)(bai)管(guan)(guan)(guan)吸光(guang)度值(zhi)(zhi)）×標(biao)準(zhun)管(guan)(guan)(guan)濃度（2μmol／ml）×樣本測(ce)試(shi)前稀釋倍(bei)數(shu)。LDH單(dan)位酶(mei)活(huo)性定(ding)義為每毫升(sheng)細胞(bao)懸液（1.0×10⁶cells）在(zai)本反應體系中使反應液中2μmol／ml2，4-二硝(xiao)基苯(ben)肼轉化為丙酮酸二硝(xiao)基苯(ben)腙所(suo)需的酶量。

　　熒光(guang)偏振法檢(jian)測細胞膜脂(zhi)流動性，配(pei)制2×10^－3mol／mlDPH母液，于用(yong)前用(yong)PBS稀釋(shi)為(wei)標(biao)記膜脂(zhi)的2×10^－6mol／mlDPH，37℃溫育30min，PBS洗滌四(si)次后懸于4ml0.1mol／LPBS中，在(zai)激發(fa)(fa)波長360nm，發(fa)(fa)射波長430nm處測定熒光偏振度P，計算膜脂流動性LFU＝0.5－P／P²。

實驗結果(guo)：

圖1：不同超聲強度下各組細胞的相對存活率

　　1、超聲輻照最(zui)佳強度的篩選

當超聲(sheng)輻照(zhao)時間為60s，不同強度的聚焦超聲對S180腹水瘤細胞的殺傷作用如圖1所示。由圖1可看出隨著聲照強度的增加，U組細胞相對存活率下降趨勢明顯，反映出細胞受損程度不斷加深。超聲強度為1W／cm²時(shi)，U組細胞相對存活率為95.83％，當其強度增加至2W／cm²時(shi)，細胞(bao)存活率下降幅(fu)度有所(suo)增加（89.67％），而當超聲強度為3W／cm²，U組細胞相對存活率驟降至61.81％（P＜0.01）。當超聲強度大于3W／cm²時，細胞相對(dui)存活率均急(ji)劇下降，但其總(zong)體趨勢趨于平緩，當(dang)強(qiang)度增加(jia)至7W／cm²時，存活率僅為2.38％，其損傷程度顯著上升。由此可見，輻照強度3W／cm²為超聲處理(li)S180細胞的強度閾值，低于3W／cm²損傷程度過小，效果(guo)不明(ming)顯，高于3W／cm²細胞受損加重，可能無法完成自(zi)身修復，而導致細胞即刻溶解(jie)。結果表(biao)明3W／cm²的(de)聚焦超聲是引發S180細胞膜損傷效應的最佳處理強度。

圖2：不同處理時間各實驗組細胞的存活率

　　2、不同(tong)超聲處理(li)時間(jian)對細胞存活率的影響

超聲照(zhao)強度為3W／cm²U組細(xi)胞存(cun)活率(lv)隨聲(sheng)照(zhao)(zhao)(zhao)時(shi)(shi)(shi)(shi)間(jian)延長而(er)(er)下降，超(chao)(chao)聲(sheng)處(chu)理15s時(shi)(shi)(shi)(shi)，其細(xi)胞相(xiang)對存(cun)活率(lv)（91.13％）較對照(zhao)(zhao)(zhao)組差異(yi)不顯(xian)著(zhu)(zhu)（P＞0.05）；當超(chao)(chao)聲(sheng)處(chu)理時(shi)(shi)(shi)(shi)間(jian)增(zeng)(zeng)加到30s時(shi)(shi)(shi)(shi)，其細(xi)胞存(cun)活率(lv)降至80.65％，與對照(zhao)(zhao)(zhao)組相(xiang)比(bi)差異(yi)較明顯(xian)（P＜0.05）；隨著(zhu)(zhu)聲(sheng)照(zhao)(zhao)(zhao)時(shi)(shi)(shi)(shi)間(jian)延長至60s時(shi)(shi)(shi)(shi)，細(xi)胞存(cun)活率(lv)較對照(zhao)(zhao)(zhao)組差異(yi)極顯(xian)著(zhu)(zhu)（61.77％）；當輻照(zhao)(zhao)(zhao)時(shi)(shi)(shi)(shi)間(jian)進一(yi)(yi)步增(zeng)(zeng)至90s時(shi)(shi)(shi)(shi)，細(xi)胞損傷程度(du)大幅度(du)增(zeng)(zeng)加（43.22％）。結果表(biao)明：超(chao)(chao)聲(sheng)對細(xi)胞造成的(de)(de)損傷程度(du)隨著(zhu)(zhu)輻照(zhao)(zhao)(zhao)時(shi)(shi)(shi)(shi)間(jian)的(de)(de)增(zeng)(zeng)加而(er)(er)升高，且30s時(shi)(shi)(shi)(shi)細(xi)胞明顯(xian)受(shou)損，而(er)(er)60s則是超(chao)(chao)聲(sheng)處(chu)理S180細(xi)胞的(de)(de)時(shi)(shi)(shi)(shi)間(jian)閾值(zhi)，因此本實(shi)驗(yan)選用30s和(he)60s作為(wei)輻照(zhao)(zhao)(zhao)時(shi)(shi)(shi)(shi)間(jian)參數(shu)以進一(yi)(yi)步研究超(chao)(chao)聲(sheng)引發的(de)(de)膜(mo)損傷的(de)(de)時(shi)(shi)(shi)(shi)效(xiao)關系。

圖3：不同處理組S180細胞FD500陽性染色率

　　3、超聲對細胞膜通(tong)透性的影(ying)響

　　大分子熒光(guang)物質FD500，通常難以進入胞膜完整的細胞。研究表明熒光右旋糖酐（FITC）不黏附在細胞膜上且FD500極少進入死細胞，因此FD500進入活細胞而使其染色可作為膜孔形成的主要標志之一。采用流式細胞儀檢測FD500熒光染色陽性細胞對照組陽性細胞率僅為1.23％，而超聲輻照30s與60s的陽性細胞率分別為14.17％和18.65％。同時由熒光顯微鏡觀察各組細胞，發現：對照組幾乎分辨不出熒光現象；30s與60s處理組的熒光。強度則明顯增加。

　　安泰(tai)ATA-8202射頻功率放大器：

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