實驗名稱：多功能明膠復合水凝膠的制備及體外構建工程化心肌組織的研究

　　研究方向：生物醫學

　　測試目的：

　　制備一種基于GelMA的三維各向異性的電磁功能復合水凝膠支架（GelMA-PDA-rGO-Fe3O4），由Fe3O4納米顆粒修飾的PDA-rGO（PDA-rGO-Fe3O4）電磁雙功能納米復合物在直流磁場驅動下定向固化。2D和3D細胞培養的實驗結果表明，獨特的各向異性結構有利于表面心肌細胞的定向生長和搏動。由于該復合水凝膠同時具有導電性和磁性，所以進行直流磁場和交流磁場磁刺激研究。結果表明交流磁場刺激和電刺激一樣也能促進細胞骨架結構發育完整、提高心肌細胞的搏動速率和頻率，以及上調心肌特異性蛋白和成熟相關基因的表達。基于GelMA-PDA-rGO-Fe3O4構建的ECT在長時間培養中表現出類似蝴蝶飛行的搏動行為，可以作為可視化藥物篩選的生物驅動器。總的來說，多功能PDA-rGO-Fe3O4復合水凝膠將是一種優異的支架材料，在心肌修復、藥物篩選和疾病模型等領域中有潛在的應用。

　　測試設備：ATA-304功率放大器、信號發生器、helmholtz線圈、載有細胞的孔板、水凝膠支架。

　　實驗過程：　

實驗之(zhi)前先進行電磁(ci)功能PDA-rGO-Fe3O4納米復合物的制備和各向異性的GelMA-PDA-rGO-Fe304電磁復合水凝膠的制備，然后進行心肌細胞的提取與2D、3D接種和培養。再進行心肌細胞的電刺激和磁刺激處理。

　　圖：靜態磁場發生(sheng)裝置實物圖

　　1、直流磁場(chang)刺激

　　心肌細胞的直流磁(ci)場刺(ci)激處理是在直流磁(ci)場發(fa)生裝置中進行的，裝置示意圖如(ru)上述圖4.1所示。將載有細胞的孔板放置于均勻磁場范圍內，當直流電流為0.87A時，產生的直流磁場強度為1.47mT，和理論值1.5mT基本一致。

　　2、交流磁(ci)場刺激(ji)

　　顧名思義，心肌細胞(bao)的(de)交流磁(ci)場刺(ci)激處理是(shi)在交流磁(ci)場發(fa)生裝(zhuang)置中進行的(de)，交變磁(ci)場發(fa)生裝(zhuang)置示意圖(tu)如(ru)圖(tu)4.2所示。與直流磁場發生裝置不同的是，交變磁場是通過信號發生器和功率放大器兩者聯合輸出放大后的正弦波電流，驅動線圈產生交變磁場。當施加的正弦波頻率為5Hz，電流為1A時，磁場強度為1mT左右。心肌細胞先靜態培養3天，再放置到均勻的交變磁場中，連續持續刺激5天。撤去磁場后再繼續靜態培養7天。無磁場刺激的實驗組作為陽性對照，GelMA-Fe3O4作為其中陰性對照。

　　圖：交(jiao)變磁場發生裝置示意(yi)圖

　　3、施加交變(bian)磁刺激(ji)對(dui)心肌(ji)細胞的功能影響

　　利用GelMA-PDA-rGO-Fe3O4磁性復合水凝膠結合外部磁刺激來構建成熟的ECT，用于以后心臟貼片和藥物篩選的研究。

　　圖(tu)4.17：用于心肌細胞磁刺激的交變磁場刺激裝置。（A）促進心肌細胞成熟的磁刺激方案。（B）磁刺激裝置示意圖，該裝置包括helmholtz線圈、信號發生器和功率放大器。磁刺激且培養到15天，各組心肌細胞（C）在兩幀之間以紅色運動矢量表示的細胞收縮矢量圖和（D）相應的搏動信號記錄曲線。標尺：500μm。各組相應的（E）自發搏動頻率和（F）搏動速率統計評價。*p<0.05和**p<0.01。

　　如圖4.17A所示，將新生大鼠心肌細胞接種到水凝膠支架上，先靜態培養3天，然后放置于交變磁場裝置中（磁感應強度為1T，圖4.17B）持續刺激5天，在第8天時撤去磁場，再靜態培養一周，總計15天。圖4.17C和4.17D展示了刺激組和對照組心肌細胞培養第15天時的搏動行為由于各向異性GelMA-PDA-rGO-Fe3O4復合水凝膠支架易于對稱性折疊，因此其表面的心肌細胞以相同的方向同步收縮；而GeMA組和各向同性復合組上的心肌細胞由于支架材料呈現非對稱性折疊，因此其表面的心肌細胞以任意的方向同步跳動。此外，刺激復合組（各向異性和各向同性復合組）中的平均搏動頻率（BPM）和靜態培養第8天一樣，均高于GelMA刺激組。如圖4.17E所示，各組的平均BPM分別為44±2（GelMA組）、60±3（各向同性復合組）和76±4（各向異性復合組），與培養第8天的平均BPM值基本一致，說明磁刺激對于心肌細胞的搏動頻率影響較小。

　　實驗結果：

　　經過磁刺(ci)激和長時間的(de)培(pei)養，各(ge)組心肌細胞的(de)搏動速(su)率均(jun)顯著增加(jia)，達(da)到了mm/s，因此肉眼可見生成的心肌組織自發地搏動。如圖4.17D和4.17F所示，定量的收縮速率（GelMA組、各向同性組和各向異性組分別為4.070.18mm/s9.48+0.46mm/s和12.40+0.63mm/s）和舒張速率（GelMA、各向同性組和各向異性組分別為2.36+0.11mm/s，3.27+0.16mm/s和11.970.62m/s）。因此，我們的結果表明由PDA-rGO-Fe304納米復合物引起的支架3D各向異性結構和磁場刺激的協同效應，促進了心肌細胞AP的快速傳遞和心肌細胞間地電耦合，驅動生成成熟的ECTS。

　　安泰ATA-304功率放大器：

　　圖(tu)：ATA-304功率放大器指標參數

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